于2015年誕生的二樓南書房對于南京來說有著非同尋常的意義，它是南京首家24小時開放的公共閱讀空間。如今，二樓南書房已在南京擁有了不少家衍生連鎖書房，如百家書房、江東書房、江寧圖書館市民中心分館等。
二樓南書房藏身于新街口一處民國建筑內，這里曾是民國時期上將劉峙的居所。書房為一棟帶有庭院的二層房屋，一樓不開放，從樓梯處拾級而上即可抵達書房，這也是書房命名的由來。二樓南書房的裝修風格受到選址影響，民國氣息濃厚，老銅壁燈、深藍繡花桌布、竹編靠椅、雕花木窗等設計元素隨處可見，頗為古色古香。
書房體量不大，由三間房間組成，面積約60平米。書房的閱讀位不到20個，人多時便稍顯擁擠，降低了閱讀體驗感。二樓南書房的藏書量不多，只有3000余冊，不過圖書的涉及面并不窄束，包括文學、歷史、政治、美學、設計、藝術等不同類別。
圖書均根據出版社分類，這些出版社大多是業界代表，如中華書局、上海譯文出版社、生活·讀書·新知三聯書店等。二樓南書房并未對圖書細分，不同類型的圖書混雜于一起，再加上書房未設圖書檢索系統，因此不方便讀者找書。在篩選圖書方面，二樓南書房主要依據豆瓣評分、亞馬遜星級標準。二樓南書房并非一味地選擇暢銷書或追求小眾，而是更看重圖書的經典型，以文學類為例，多是加西亞·馬爾克斯、米蘭·昆德拉等經典作家的著作。
作為一家24小時書房，二樓南書房為過夜的讀者提供免費飲用水與付費飲品，如咖啡、茶等，價格適中。書房備有閱讀燈、熱水壺與紙巾，并設有洗手間。
與南京大部分書店相比，二樓南書房所舉行的線下活動不多，且由于場地限制，書店活動多為小型講座，形式單一。二樓南書房及其衍生連鎖書店的活動各有不同，讀者在書店公眾號內報名參與活動。二樓南書房不出售圖書，書店內的圖書皆可免費閱讀，若需要借閱圖書，則需要辦理會員卡，并交納押金，金額通常為百元左右，具體信息以官方為準。
